Домой Наука Количественный мониторинг изменений контраста татуировки после обработки лазером 755 нм в моделях...

Количественный мониторинг изменений контраста татуировки после обработки лазером 755 нм в моделях татуировок in vivo

240
0

6-1

Количественный мониторинг изменений контраста татуировки после обработки лазером 755 нм в моделях татуировок in vivo

Дерматологи использовали лазерное излучение для удаления татуировок посредством фототермического взаимодействия. Однако в большинстве клинических исследований использовался метод визуальной оценки для менее объективной оценки процесса удаления татуировки, что приводило к ненужному лечению. Это исследование было направлено на разработку простого и количественного метода визуализации для мониторинга степени удаления татуировок на моделях кожи in vivo. Модели крыс Sprague Dawley были татуированы четырьмя различными концентрациями черных чернил. Лазерное лечение татуировок проводилось еженедельно с использованием длины волны 755 нм в течение шести недель. Изображения необработанных и обработанных образцов получали одним и тем же методом после каждой обработки. Интенсивность татуировок измеряли для оценки контраста для количественного сравнения. Результаты показали, что предложенный метод мониторинга позволяет количественно оценить вариации контрастности татуировки после лазерной обработки. Гистологический анализ подтвердил значительное удаление татуировок, отсутствие термического повреждения прилегающих тканей и равномерное ремоделирование эпидермального и дермального слоев после нескольких процедур. Это исследование продемонстрировало потенциал метода количественного мониторинга в объективной оценке степени клиренса во время лазерного лечения в клиниках.

Введение

Татуировки сыграли важную роль в различных человеческих культурах. Они представляют собой форму боди-арта, при котором чернила вводятся в дерму кожи. Когда чернила вводятся в дерму, иммунная система, которая распознает молекулы чернил как чужеродные вещества, запускается для рекрутирования макрофагов. Однако чернила остаются, потому что лизосомальные ферменты все еще неактивны в компонентах чернил. Люди с татуировками иногда стремятся удалить татуировки по разным причинам, например, из-за изменения социального статуса, неудовлетворенности и медицинских проблем. Следовательно, требуется квалифицированный процесс удаления. Различные методы удаления татуировок включают хирургическое удаление и химическое разрушение. Однако удаление лазером в настоящее время считается одним из самых эффективных методов, поскольку оно применяется избирательно. Лазерный подход нацелен на определенные хромофоры и имеет минимальное взаимодействие с прилегающей тканью, что делает его более специфичным, менее инвазивным и связанным с меньшим количеством побочных эффектов. Были оценены несколько длин волн лазера, чтобы продемонстрировать их клинические результаты. Например, CO2-лазер (10, 6 мкм) использует низкое поглощение света для пигментов татуировки, что вызывает нежелательные фиброзные рубцы после лечения. Напротив, лазеры видимого (532 нм) или ближнего инфракрасного диапазона (755 и 1064 нм) могут избирательно разрушать частицы пигмента короткими и интенсивными лазерными импульсами посредством селективного фототермолиза. В частности, длины волн 755 и 1064 нм показали стимуляцию воспалительных реакций, которые могут устранить фрагментированные гранулы татуировки через лимфатические сосуды.

Несколько исследований были широко проведены по лазерному удалению татуировок в доклинических и клинических условиях. Обычно лазерное удаление проходит через несколько сеансов лечения, чтобы полностью удалить чернила татуировки. Однако в предыдущих исследованиях плохо понималась количественная информация о количестве остаточных чернил на татуировках после каждой обработки. Дерматологи обычно используют систему баллов для измерения исчезновения татуировок после лазерной обработки. Система баллов основана на клинической шкале: плохое (удаление < 25%), удовлетворительное (удаление 26% –50%), хорошее (удаление 51% –75%) и отличное (удаление 76% –100%). Однако оценка субъективно анализируется медицинскими экспертами и вряд ли может служить количественным показателем количества удаленных чернил с татуировок, что приводит к ненужным сеансам лечения. Более того, побочные эффекты лазерной татуировки включают фиброзные рубцы, гипо- или гиперпигментацию, а также изменение цвета пигмента татуировки из-за неполного удаления или чрезмерного / накопленного термического повреждения после нескольких сеансов лечения. Поэтому необходимо установить надежный и объективный метод оценки степени удаления татуировки после каждого сеанса лазерного лечения.

В этом исследовании был разработан метод количественного мониторинга для измерения временных изменений контраста татуировки после лазерной обработки на 755 нм в моделях татуировки in vivo. Было высказано предположение, что оценка контраста изображения между до и после лечения может надежно количественно определить степень очистки татуировок после каждого лечения. На татуировках на коже in vivo проводилось многократное лазерное лечение с длиной волны 755 нм с четырьмя различными концентрациями. Дополнительный датчик металл-оксид-полупроводник (CMOS) использовался для мониторинга каждой татуировки обработанной кожи, а полученные изображения оценивались с точки зрения контраста татуировки в течение шести недель. Также был проведен гистологический анализ для подтверждения наличия татуировочных чернил под эпидермисом и оценки любых термических реакций в обработанной ткани и заживления ран после лечения.

Материалы и методы

Подготовка животных

Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных в Национальном университете Пукён. Всего восемь крыс-самцов Sprague Dawley (в возрасте шести недель и весом 150–200 г) были использованы в качестве животных моделей для этого исследования. Перед экспериментами все животные вдыхали изофлуран для анестезии. Спину каждой крысы брили машинкой для стрижки, а волосы полностью удаляли с помощью воскового крема. Татуировки были сделаны с использованием возвратно-поступательного вибрационного иглодержателя и черных чернил, которые вводили в кожу менее чем на 1 мм ниже эпидермиса. Восемь линий татуировки длиной 1, 5 см (1 см друг от друга; толщина ~ 1, 5 мм) были созданы на спине каждой крысы в ​​различных концентрациях. Чтобы отразить клинические условия татуировки (свежие или бледные), в текущем исследовании тестировались четыре различных концентрации (т. е. 25%, 50%, 75% и 100%) путем разбавления чернил раствором. Краски для татуировок каждого типа вводили четыре раза (каждые три дня), чтобы полностью установить линию татуировки на коже. Таким образом, лазерная обработка была проведена после того, как татуировки были надлежащим образом выгравированы (то есть всего через 12 дней). Линии татуировок каждой концентрации создавали на коже для двух групп, а именно: контрольной (необработанной) и обработанной лазером групп. Всего было приготовлено 64 образца (т.е. количество концентраций × количество строк × количество групп = 4 × 8 × 2 = 64).

Лазерное лечение

В качестве источника света для татуажа использовалась индивидуализированная длинноимпульсная лазерная система с длиной волны 755 нм. Лазерная система работала с энергией импульса 5 Дж, частотой 1 Гц и диаметром луча 6, 5 мм, чтобы имитировать клинические условия лечения. Соответствующий флюенс составлял 15 Дж / см2, и каждую линию татуировки вручную обрабатывали пятью импульсами лазерного излучения с длиной волны 755 нм. После каждых пяти импульсов луч перемещался на 5 мм в сторону, пока он не покрыл всю линию (т.е. 15 импульсов на линию татуировки). Фотографии были сделаны на необработанных (неделя 0) и обработанных татуировках в неделю после каждого лечения (неделя 1-6) с использованием датчика CMOS, чтобы отслеживать коллективные реакции на изменения контрастности, вызванные воздействием лазера, и процессы заживления тканей. Датчик захватил 2464 × 1632 изображения с размером пикселя 2, 8 × 2, 8 мкм. Поскольку предложенный метод предполагал применение в настройках сообщества для упрощения принятия и настройки, каждое изображение было получено при освещении лампами накаливания (60 Вт и 800 люмен), и фильтр изображения не применялся. Для согласованного сбора данных для постэкспериментального анализа постоянно поддерживались условия визуализации (интенсивность источника света освещения, расстояние 10 см по вертикали между плоскостями изображения и объекта и отсутствие окружающего света).

Анализ контрастности

Через неделю после каждой еженедельной обработки образцы, обработанные лазером, фотографировали для измерения контраста. Получение изображения и анализ были выполнены, чтобы отразить общую степень уровня очистки после физического удаления и последующего заживления ран, полученного в результате лечения на предыдущей неделе. После того, как изображение было снято, была проведена следующая обработка. Из каждой линии татуировки случайным образом были выбраны пять различных участков, и соответствующая интенсивность в оттенках серого была измерена с использованием программного обеспечения Image J (Национальный институт здравоохранения, Бетесда, Мэриленд). Область без татуировок использовалась в качестве фона, и ее интенсивность также была определена количественно для справочных целей. Чтобы свести к минимуму ошибки измерения полученных изображений, изменение контраста (C) между фоном и обработанным участком было рассчитано с использованием следующего уравнения:

Изменение контрастности (C) = (IB — IT) / IB × 100 (1)

где IB и IT — интенсивности, измеренные от фона и татуировки соответственно. Контрастность, оцененная после лазерной обработки (неделя 1–6), сравнивалась с оценкой до лечения (т. е. без лечения; неделя 0), чтобы количественно оценить степень удаления татуировки после лазерной обработки.

Гистология

Гистологический анализ был проведен для подтверждения пространственного распределения частиц чернил как в необработанных, так и в обработанных татуировках на коже, накопленных термических повреждений и реакции заживления ран татуировки после нескольких процедур в течение шести недель. После завершения шести процедур лазерной обработки все животные были умерщвлены, а кожная ткань была собрана. Извлеченные образцы фиксировали в 10% -ном формалине в течение 48 ч. После обработки ткани образцы заливали парафином и делали срезы толщиной 6 мкм. Затем все срезы тканей окрашивали гематоксилином и эозином (HE), и окрашенные слайды наблюдали с помощью оптического микроскопа для получения изображений (увеличение = × 100). Для количественной оценки степени изменений эпидермиса между нормальной и обработанной тканями рассчитывали их индекс толщины эпидермиса (ETI) путем нормализации толщины эпидермиса, измеренной для обработанных тканей, на толщину нормальной ткани.

Статистический анализ

Все полученные данные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. U-критерий Манна-Уитни был проведен для непараметрического статистического анализа, где p <0,05 выражает статистическую значимость выборки данных.

Полученные результаты

Стадия до лечения (неделя 0; крайний левый столбец) показала, что более высокие концентрации указывают на более отчетливые линии татуировки. Например, 100% было связано с относительно темной черной линией, а 25% — со слегка тусклой линией. Независимо от концентрации чернил, еженедельная лазерная обработка продолжала вызывать ощутимое уменьшение количества остаточных татуировок со временем. На 6 неделе более низкие концентрации (25% и 50%) привели к значительному удалению татуировок (почти неразличимому), в то время как самая высокая концентрация (100%) оставила относительно различимую линию татуировки. Было подтверждено, что контрольная группа (не подвергавшаяся лечению; 6-я неделя) сохраняла сравнимую степень концентрации татуировок в течение четырех недель с таковой с 0-й недели (до лечения).

Контраст татуировки был количественно определен как функция времени для необработанных и обработанных групп с четырьмя концентрациями. Контрольная (необработанная) группа показала, что три концентрации (50%, 75% и 100%) привели к снижению контрастности до 25% через шесть недель (неделя 0: 57,4 ± 2,7% по сравнению с 6 неделями: 32,8 ± 3,4% на 100%; р <0,05). Самая низкая концентрация (25%) снизила контраст примерно на 9% (неделя 0: 32,2 ± 6,0% по сравнению с неделей 6: 22,8 ± 3,2% для 25%; p <0,05). Несмотря на более низкий контраст, общие изменения контраста для 25% концентрации имели тенденцию, сравнимую с таковыми для других концентраций. Таким образом, было подтверждено, что все контрольные группы сохраняли татуировку на коже почти всегда в течение шести недель.

Напротив, обработанные группы показали отчетливое и быстрое снижение контрастности татуировки (до 49%) при многократном лечении для всех концентраций (неделя 0: 57,8 ± 2,9% по сравнению с неделей 6: 9,0 ± 6,6% на 100%; р <0,05). Степень еженедельного снижения контрастности была значительно одинаковой для всех обработанных групп. Количественный мониторинг непрерывного снижения контрастности в обработанных группах показал, что лазерное лечение может удалить больше чернил для татуировки.

Сравниваются линии татуировки с четырьмя различными концентрациями чернил в группах, не получавших лечения (неделя 0) и обработанных лазером (неделя 6). Все концентрации давали характерные линии татуировки на коже. После шести недель лечения полученные изображения подтвердили, что все линии татуировок явно стали бледными. Степень остаточной татуировки постепенно увеличивалась с увеличением концентрации. Контраст татуировки увеличивался с концентрацией чернил для обеих групп. Пунктирная рамка на необработанном изображении качественно подтверждает наличие введенных татуировочных (черных) чернил в дермальном слое. После шести процедур обработанные группы подтвердили очевидное исчезновение введенных частиц чернил с кожи.

Неделя 1 (первая обработка) показала частично удаленную линию татуировки, тогда как следующая процедура (неделя 2) привела к значительному удалению линии татуировки (концентрация = 50%). Напротив, как неделя 5, так и неделя 6 привели к относительно невидимым линиям татуировки и почти незаметным изменениям в татуировках после последовательных процедур. Для всех концентраций более ранние процедуры (1-2 недели) вызывали заметные изменения контрастности татуировки (до 17%). Однако более поздние процедуры (недели 3–4 и недели 5–6) сопровождались аналогичными изменениями контрастности (около 5%). Более значительные изменения в каждый период были вызваны частичным удалением линии татуировки из-за неравномерного накопления молекул чернил и возникающих в результате неоднородных взаимодействий с лазером. Этот метод мониторинга подтвердил, что эффективность удаления татуировок может существенно снизиться при увеличении частоты лазерного лечения.

Несмотря на шесть еженедельных курсов лечения, качественно термических повреждений эпидермиса и дермы при всех концентрациях обнаружено не было. Было отмечено, что реконструированные структуры кожи после процедур казались эквивалентными структуре нормальной ткани, независимо от концентрации. Очевидно, обработанные ткани изменили толщину эпидермиса, сравнимую с толщиной нормальной ткани, даже после шести лазерных процедур (ETI = 1,0–1,1). Определенные количественные соотношения толщины также подтвердили, что ремоделирование эпидермальных слоев было значительно однородным и не наблюдалось накопленного термического повреждения во всех концентрациях.

Обсуждение результатов

Это исследование было направлено на разработку объективного и поддающегося количественной оценке метода мониторинга изменений контрастности татуировки после обработки лазером с длиной волны 755 нм на моделях кожи in vivo. В отличие от существующей системы оценки, используемой для клинической оценки, предложенный метод мониторинга качественно и количественно показал существенное снижение контрастности татуировки после еженедельного лазерного лечения. Поскольку субъективный визуальный осмотр процедур татуировки часто приводит к ненужным сеансам лечения, установление объективного и количественного подхода для оценки степени удаления татуировки является клинически неудовлетворенной потребностью. Предлагаемый анализ изображений может позволить количественно отслеживать вариации татуировок в клиниках.

Кроме того, реализация предлагаемого метода с помощью смартфонов или недорогих альтернативных устройств может облегчить клинические возможности и признание медицинским сообществом. Непрерывная визуализация с помощью таких реализаций может даже обеспечить дополнительные преимущества для мониторинга степени удаления татуировки. Еженедельные изменения контрастности, очевидно, показали количество вариаций уровня клиренса для каждого лечения, которые можно использовать для определения оптимального количества лазерных процедур, чтобы избежать ненужных процедур. Гистологический анализ подтвердил значительное удаление татуировок, отсутствие термического повреждения прилегающей ткани и равномерное ремоделирование эпидермального / дермального слоев после нескольких процедур. Таким образом, предлагаемый метод мониторинга может быть неинвазивным методом быстрой и количественной оценки физического состояния кожи после лазерной обработки и, в конечном итоге, улучшения клинических результатов лазерного удаления татуировки за счет минимизации количества процедур.

Конечная цель лазерного удаления татуировок — это фрагментация частиц краски для тату, которые легко удаляются иммунной системой хозяина с кожи. Основным механизмом взаимодействия лазерных татуировок считается фототермический, и степень удаления татуировки также может влиять на свойства молекул пигмента. Это исследование было направлено на количественную оценку физических реакций красок для татуировок с различными концентрациями на импульсное лазерное облучение. Предполагалось, что в чернилах с более высокой концентрацией было удалено больше частиц из-за большего поглощения света хромофорами татуировки. Однако общий контраст татуировки был ниже при более низких концентрациях, чем при более высоких концентрациях. Эти данные свидетельствуют о том, что применяемая лечебная доза может быть эффективной для удаления определенной степени чернил для татуировки из-за различных размеров и пространственного распределения вводимых частиц. Возникающие в результате взаимодействия хромофоров с лазерным светом обычно сопровождают частичное поглощение и рассеяние падающего света, тем самым приводя к перераспределению частиц. Дальнейшие исследования будут проводиться с целью оценки оптического и теплового воздействия частиц татуировки на эффективность лазерной обработки татуировки с точки зрения размера, плотности, пространственного распределения и зависимости от ряда процедур. Кроме того, с использованием предложенного метода будет исследована дозировка лечения, зависящая от концентрации, для определения оптимального планирования лечения.

В клинических исследованиях по лечению татуировок использовались показатели клинической оценки для выявления любого уменьшения количества обработанных татуировок. Однако клиническая оценка может быть субъективной и неколичественной, потому что баллы выставляются медицинскими экспертами или слепыми исследователями. В качестве альтернативного метода были разработаны количественные оценки с использованием моделей на животных. В исследовании по оценке воздействия лазера на морских свинок Хартли с разноцветными татуировками использовался колориметр для измерения любых изменений пигментации. Однако расчет оптической плотности по-прежнему был сложным, и метод просто показывал общее снижение между предварительной и последующей обработкой, тогда как предлагаемый метод мог отслеживать изменения в контрасте татуировки даже во время заживления ран.

В другом исследовании с использованием моделей на крысах сообщалось о применении прибора для оценки состояния кожи для определения содержания пигмента до и после лазерной обработки, а также для оценки скорости выведения. Однако количественное измерение требовало процесса, при котором инструмент плотно прикладывали к коже животного в вертикальном направлении. Более того, интенсивность черных точек на изображении татуированной области была определена количественно для оценки эффективности лазерной обработки с использованием инструмента регулировки цветового порога на изображении J. Однако процесс корректировки пороговых значений часто был субъективным (зависел от измерителя). Несколько итераций также были необходимы для минимизации ошибок измерения и достижения надежности оценки. Формула для определения скорости клиренса была более сложной и менее точной, чем предложенный метод, с прямым сравнением интенсивностей между фоновой и обработанной областями. В отличие от колориметра и прибора для оценки кожи, датчик на основе КМОП может обеспечить простую и экономичную настройку для получения согласованных изображений с высокой точностью. Таким образом, это исследование продемонстрировало простой метод использования 2D-изображений с CMOS-датчиком для надежного и количественного контроля степени уменьшения при лазерной обработке.

Хотя это исследование продемонстрировало метод количественного мониторинга с использованием датчика CMOS для оценки степени удаления татуировки, экспериментальные ограничения все еще остаются. Предложенный длинноимпульсный (3 мс) лазер не привел к накоплению термических повреждений, но более длительные импульсы могут повредить окружающие ткани, если не соблюдается тепловое ограничение (т. е. Длительность импульса больше, чем время тепловой релаксации 3 –10 мс). Более того, в этом исследовании измерялась интенсивность линий татуировки в оттенках серого, потому что использовались только черные чернила для тату. Тем не менее, важно понимать, может ли метод мониторинга применяться для различных цветов татуировок, таких как красный, зеленый и синий. Таким образом, в дальнейших исследованиях предложенный метод мониторинга будет применяться к лазерным процедурам с короткой длительностью импульса для подтверждения текущих результатов в моделях цветных татуировок. Кроме того, эффективность фрагментации частиц лазерным светом (т.е. более низкий терапевтический эффект) зависит от глубины пигментных частиц в коже. Чтобы гарантировать равномерное распределение чернил для татуировки, перед лазерной обработкой необходимо разработать метод контроля глубины татуированной кожи. Несмотря на подтверждение первоначального существования и полного удаления молекул татуировки, гистологические изображения с трудом могли визуализировать частичное присутствие остаточных молекул чернил, возможно, из-за уменьшенного / рассеянного распределения чернил, ограниченного разрешения изображения и относительно неточного сечения ткани.

Условия освещающего света могут быть еще одним критическим фактором для получения изображений и измерений интенсивности с помощью изображения J. Получение изображений должно выполняться без изменений внешних условий, включая окружающее освещение для клинического перевода. Кроме того, ограничение следует минимизировать, измеряя интенсивность фона и татуировки одновременно. Конечная цель — количественно оценить изменения контраста в режиме реального времени и определить оптимальное количество лазерных процедур. Следовательно, оптимальное (или минимальное) количество процедур может привести к снижению стоимости клинического лечения татуировок, а также любой связанной с лечением боли, которую могут испытывать пациенты.

Выводы

В этом исследовании мы разработали метод количественного мониторинга изменений контраста татуировки после лазерной обработки с длиной волны 755 нм на моделях кожи in vivo. Предложенный метод мониторинга качественно и количественно оценил контраст татуировки и подтвердил отсутствие термического повреждения после нескольких процедур. Положительные результаты предлагаемого метода будут далее оцениваться с использованием лазерных систем с более короткими импульсами в моделях цветных татуировок, чтобы оптимизировать количество процедур для клинического перевода.